迁徙到岛上的南岛系民族由此形成了自己独特的民族文化。1521年3月6日航海家麦哲伦在进行人类历史上第一次环球航行时发现了关岛。麦哲伦船队在岛上休整时遭到了岛上原住民的洗劫，因此麦哲伦把包括关岛在内的马里亚纳群岛命名为”盗贼群岛”。麦哲伦船队在关岛停留的三天内补充了食物和淡水，然后他们继续出发并于一周后抵达了菲律宾群岛。尽管麦哲伦本人于1521年4月27日死在了菲律宾群岛，然而船队幸存下来的18人于1522年9月8日回到了西班牙。

人类历史上第一次环球航行就这样完成了。尽管麦哲伦是葡萄牙人，不过他的远航是受到西班牙王室资助的，所以这次远航后西班牙人的势力开始扩张到关岛。当时西班牙人给这个小岛起了名字叫做“三角帆之岛”。1565年西班牙德雷加斯比将军正式声明把该岛纳为西班牙的领地。这时西班牙已确立了对菲律宾的殖民统治。从菲律宾前往西班牙的美洲殖民地需要跋涉上万公里，而从菲律宾的吕宋岛到马里亚纳群岛的直线距离只有大约2500公里、航线距离约为3000公里。

马里亚纳群岛因此成为了西班牙无敌舰队海上重要的中转站，在此之前无人问津的孤岛终于有了重要的战略价值。关岛作为马里亚纳群岛最南端的岛屿也日益凸显出战略地位。西班牙殖民关岛期间对岛上的土著居民查莫罗人进行了种族灭绝式的大屠*。西班牙人统治关岛39年之后岛上的查莫罗人从10万人锐减至5千人。如今生活在关岛的查莫罗人都是与西班牙人以及曾被西班牙统治的墨西哥、菲律宾等地的人融合同化后的混血后裔。1732年西班牙传教士把天主教传播到了关岛。

西班牙在统治关岛的四百年间基本上没进行任何殖民开发。事实上西班牙对很多殖民地采取的都是放任自流的态度：只从当地掠夺财富，然而对当地的发展并不上心。从17世纪起西班牙帝国就已由盛转衰：西班牙无敌舰队被英国海军击败标志着西班牙的海上霸权开始衰落，1648年西班牙在与法国的战争失利后又失去了陆地上的军事优势。1700年西班牙国王卡洛斯二世去世后他的玛丽亚·特蕾莎和法国国王路易十四的孙子菲利普继承了西班牙王位。