紫外-可见分光光度法是根据物质分子对紫外-可见光（200~760nm范围）的吸收特性建立起来的一种定性和定量分析方法，根据辐射本质属于分子光谱法，根据能量传递方式属于吸收光谱法。

一、透光率和吸光度

光的吸收程度与光通过物质前后的光的强度变化有关。光强度是指单位时间（1 s）内照射在单位面积（1 cm2）上的光的能量，用I表示。它与单位时间照射在单位面积上的光子的数目有关，与光的波长无关。

溶液吸光示意图

二、光的吸收定律

（一）朗伯-比尔定律

朗伯和比尔分别于1760年和1852年研究了光的吸收与溶液液层厚度及溶液浓度的关系，得出光的吸收定律为：A= klc （3-3） 该式称为朗伯-比尔定律。

式中， A为吸光度；c为溶液浓度；l为液层厚度；k为吸光系数，并与入射光波长、溶液的性质、温度等因素有关。当一束平行的单色光通过某一均匀、无散射的含有吸光物质的溶液时，在入射光波长度、强度以及溶液温度等因素保持不变的情况下，该溶液的吸光度A与溶液浓度c及液层厚度l的乘积成正比关系。朗伯-比尔定律是分光光度法定量分析的依据。

朗伯-比尔定律不仅适用于可见光，也适用于红外光、紫外光；不仅适用于均匀、无散射的溶液，也适用于均匀、无散射的气体和固体。在同一波长下，各组分吸光度具有加和性，即如果溶液中同时存在多种吸光物质，那么测得的吸光度则是各吸光物质吸光度的总和。其表达式为：

这也是利用朗伯-比尔定律能够对多组分物质进行分光光度分析的理论基础。

（二）偏离朗伯-比尔定律的因素

根据朗伯-比尔定律，对于同一种物质，当吸收池的厚度一定，以吸光度对浓度作图时，应得到一条通过原点的直线。但在实际工作中，吸光度与浓度之间的线性关系常常发生偏离，产生正偏离或负偏离，如图所示。

朗伯-比尔定律偏离

朗伯-比尔定律的主要原因有：

1.非单色光的影响 在紫外-可见分光光度计中，使用连续光源和单色器分光时，得到的不是严格的单色光。并且，在实际测定中，为了保证足够的入射光强度，分光光度计的狭缝必须保持一定的宽度。因此，由出射狭缝投射到待测样品上的光，并不是理论上要求的单色光，而是具有较窄波长范围的复合光带，复合光带会引起实际测量与理论值之间存在一定的差异，从而使实际得到的曲线偏离朗伯-比尔定律。

2.非均相体系的影响 当待测样品溶液含有悬浮物或胶粒等散射质点时，入射光经过不均匀的样品，会有一部分光因发生散射而损失，从而使透光强度减小，致使偏离朗伯-比尔定律。

3.溶液本身发生化学变化的影响 在测定过程中，溶液中的吸光物质发生解离、缔合、光化等化学作用，可引起吸光物质浓度的变化，从而导致吸光度改变，偏离朗伯-比尔定律。

4.浓度的限制 朗伯-比尔定律假定吸光质点之间不发生相互作用，因此只有在稀溶液时才基本符合。当溶液浓度较高（通常认为c>0.01 mol /L）时吸光质点间可能发生缔合等相互作用，直接影响物质对光的吸收。综上所述，利用朗伯-比尔定律进行测定时，应使用平行的单色光对浓度较低的均匀、无散射、具有恒定化学环境的待测样品溶液进行分析。

三、吸光系数

光的吸收定律中吸光系数k的物理意义为：液层厚度为1 cm的单位浓度溶液的吸光度。在给定的单色光、溶剂和温度等条件下，吸光系数k是物质的特征常数，表示物质对特定波长光的吸收能力。k愈大，表示该物质对光的吸收能力愈强，测定的灵敏度愈高。当溶液的浓度c单位不同时，吸光系数的意义和表示方法也不相同，常用摩尔吸光系数和百分吸光系数表示。

1.摩尔吸光系数 当溶液的浓度c以物质的量浓度表示时， k称为摩尔吸光系数，用符号ε表示。ε的单位为L/（mol·cm）。ε在数值上等于吸光物质浓度为1 mol /L、液层厚度为1 cm时溶液的吸光度。通常认为ε≥104时为强吸收，ε<102时为弱吸收，ε介于两者之间时为中强吸收。在定量分析中，可以利用ε值评价方法的灵敏度。ε值越大，测定的灵敏度越高。因此，在分析工作中，常通过实验条件的选择以使吸光物质的ε值尽可能的大，从而获得尽可能高的灵敏度。

2.百分吸光系数 也称为比吸光系数，指溶液浓度在1%（1 g/100ml），液层厚度为1 cm时，在一定波长下的吸光度值，用符号E1%1 cm表示，其单位为100ml /（g·cm）。百分吸光系数和摩尔吸光系数有如下关系：

式中， M为吸光物质的相对分子质量。ε（或E1%1 cm）不能直接测得，而是通过测定已知准确浓度的稀溶液的吸光度，再经换算而得。一般ε值大于103时即可进行分光光度法定量测定。

四、吸收光谱

在溶液浓度和液层厚度一定的条件下，测定溶液对不同波长单色光的吸光度，以波长λ为横坐标，以吸光度A为纵坐标作图，得到光吸收程度随波长变化的关系曲线称为吸收光谱。

吸收光谱曲线示意图

如图所示，一定浓度的溶液对不同波长光的吸收程度不同，在光谱吸收曲线中吸收最大且比左右相邻都高之处，称为吸收峰，对应的波长称为最大吸收波长用λmax表示。其中峰与峰之间比左右相邻都低之处，称为谷，其对应波长用λmin表示。在吸收峰旁曲折处的峰称为肩峰，其对应波长用λsh表示。在吸收光谱中曲线波长最短，呈现出强吸收，吸光度大但不成峰形的部分称为末端吸收。

分析物质的吸收光谱会发现：

1.每种物质都有自己特征的紫外-可见吸收光谱。

2.同一物质对不同波长光的吸光度不同。

3.溶液浓度改变时，吸收光谱曲线形状相似，λmax不变，但在同一波长处的吸光度随溶液浓度升高而增大。

4. 吸光度（A）随浓度变化的程度随波长不同而不同，在λmax处的改变幅度最大，即在此波长处进行定量测定时，浓度的微小变化可使吸光度有较大改变，测定的灵敏度高。在定量分析时，要首先测定物质的吸收光谱曲线，确定λmax，并在此波长下进行测定。

吸收光谱曲线是定量分析选择入射波长的重要依据。