【实验目的】

（1）学习乳酸发酵和制作乳酸菌饮料的方法。

（2）了解乳酸菌的生长特性。

【实验原理】微生物在厌氧条件下分解己糖产生乳酸的作用，称为乳酸发酵。能发酵糖产生乳酸的细菌通称为乳酸细菌。常见的乳酸细菌属于链球菌属（Streptococcus）、乳杆菌属（Lactobacillus）、双歧杆菌属（Bifidobacterium）和明串珠菌属（Leuconostoc）等。乳酸细菌发酵产生的乳酸和厌氧生活的环境，能够抑制一些腐败细菌的活动，故可利用乳酸发酵制造青贮饲料及日常生活中腌制泡菜等。乳酸细菌多是耐氧菌，在厌氧条件下进行乳酸发酵，所以在筛选乳酸菌或需要进行乳酸发酵的情况下，应保证提供厌氧条件。酸奶是以全脂牛奶等为原料，经乳酸细菌发酵而成的一种具有较高营养价值和特殊风味的发酵制品，是具有一定保健作用的食品。制作酸奶的基本原理是通过乳酸细菌发酵牛奶中的乳糖产生乳酸，乳酸使牛奶中的酪蛋白变性凝固而使整个奶液呈凝乳状态。同时，通过发酵还可以形成酸奶特有的风味和香味。按凝固状态不同，酸奶分为搅拌型酸奶和凝固型酸奶，两者工艺过程基本相似。本实验主要学习凝固型酸奶的制作方法。

【实验器材】

1．菌种嗜热乳酸链球菌（Streptococcus thermophilus）、保加利亚乳酸杆菌（Lactobacillus bulgaricus），也可以从市场销售的各种新鲜酸奶或酸奶饮料中得到菌种。

2．培养基MRS琼脂培养基、马铃薯牛奶琼脂培养基。

3．仪器和用具恒温水溶锅、酸度计、高压蒸汽灭菌锅、超净工作台、培养箱等。

4．其他材料脱脂乳粉或全脂乳粉、鲜牛奶、蔗糖、碳酸钙。

【实验步骤】

1．乳酸菌的分离

（1）倒平板：将MRS琼脂培养基和马铃薯牛奶琼脂培养基加热融化，冷却至45℃左右，分别各倒3个平板。

（2）样品稀释：取市售新鲜酸奶稀释至10-5。

（3）平板分离：取其中的10-4、10-5两个稀释度的稀释液各0.1mL，分别接入培养基平板上，用无菌涂棒依次涂布（或者直接用接种环沾取原液平板划线分离）。

（4）恒温培养：将培养皿置于37℃恒温箱中培养48h，也可放入厌氧罐中培养。

（5）菌落鉴别：在马铃薯牛奶琼脂培养基上，如出现圆形稍扁平的淡黄色菌落，或菌落周围出现水解透明圈者，可初步定为乳酸菌。

（6）形态观察：选取乳酸菌典型菌落，接入消毒牛奶试管中，40℃培养8～24h，若牛乳出现凝固，无气泡，呈酸性，镜检细胞呈杆状或链球状（两种形状的菌种均分别选入），革兰氏染色呈阳性，则可将其连续传代4～6次，作为菌种待用。

2．乳酸发酵及检测

（1）发酵：按无菌操作将分离的乳酸菌株接种于装有300mL乳酸菌培养基的三角烧瓶中，于40～42℃静止培养。为了便于测定乳酸发酵情况，实验分2组。一组在接种培养后，每6～8h取样分析，测定pH值；另一组在接种培养24h后每瓶中加入CaCO3（以防止发酵液过酸，使菌种死亡）3g，每6～8h取样分析。

（2）定性检测：取上述培养液约10mL于试管中，加入10％H2SO41mL，再加2％KMnO41mL，此时乳酸转化为乙醛。把事先在含氨的硝酸银溶液中浸泡的滤纸条搭在试管口上，微火加热试管至沸，若滤纸片变黑，则说明有乳酸存在。

3．乳酸菌饮料的制作

（1）培养基：将奶粉和水以1∶（7～10）（m/V）的比例配成还原奶，同时加入5％蔗糖，充分混合，于85～90℃消毒15min，然后冷却至35～40℃，作为制作饮料的培养基质。

（2）接种：分别以纯种嗜热乳酸链球菌、纯种保加利亚乳酸杆菌及两种菌的等量混合菌液作为发酵剂，以体积分数为2％～5％的接种量接入以上培养基质中。接种后摇匀，分装到已灭菌的牛奶瓶中，随后将瓶盖拧紧密封。亦可按5％～10％（V/V）比例将市售新鲜酸奶为发酵剂进行接种。

（3）培养：把接种后的酸奶瓶置于40～42℃恒温箱中培养3～4h。培养时注意观察，在出现凝乳后停止培养。然后转入4℃的低温下冷藏24h以上。经此后熟阶段，达到酸奶酸度适中（pH4～4.5），凝块均匀致密，无乳清析出，无气泡，获得较好的口感和特有风味。

（4）品尝：通过品尝评定酸奶质量，比较单菌株发酵和混合菌株发酵的酸奶质量，主要包括香味和口感。若出现异味，表明酸奶污染了杂菌。

【实验报告】

1．实验结果

（1）描述MRS琼脂培养基上乳酸菌的菌落特征和镜检细胞特征。

（2）将发酵的酸奶品评结果记录于下表中。

表12-1　乳酸菌单菌及混合菌发酵的酸奶品评结果

2．思考题

（1）发酵酸奶为什么能引起凝乳？

（2）为什么采用乳酸菌混合发酵的酸奶比单菌发酵的酸奶口感和风味更佳？

（3）试设计从市售泡菜中分离纯化乳酸菌及泡菜制作的实验方案。

（董新娇）