将某一真菌与自然界的其它真菌分离开，而成为单一的纯菌株，就是菌种分离。要栽培食用菌，就要首先得到所要栽培菌的。分离工作应该是在很清洁的无菌环境下进行。无菌操作间或无菌操作箱，是不可缺少的设备。无菌操作间或无菌操作箱在工作前，事先要进行灭菌和消毒处理，通常是先在室内喷洒水雾以消除悬浮在空气中的尘埃及微生物，然后配制2%的煤酚皂液，或1：40福尔马林溶液喷酒消毒，或者可用高锰酸钾加上乳酸后产生蒸汽消毒。无菌操作室中或无菌操作箱内装置紫外光灯，则更能保证其灭菌状态。

除工作环境外，工作人员应保持自身的清洁，在工作前应用肥皂水洗手，有条件时应穿上灭菌后的工作服并带日罩。对分离材料处理：因食用菌有特殊的子实体，所以分离菌种时可利用其子实体进行直接分离，在分离前要将材料进行无菌处理。外表消毒用75%的酒精擦外表或用0.2%的升汞液浸泡3~ 5分钟，再用无菌水冲洗7 ~ 8次，以达到分离材料外表不带杂菌。具体分离有下列3种方法：

（1）.组织分离法 选择子实体肥大，无病虫害，经济性状好，产量高，质量好的个体作为分离材料，用小刀在子实体上取一小块菌肉，移放在斜面培养基中央，放在25一27℃的恒温箱中培养2~3天，组织块上长出白色菌丝，移植到斜面进行纯化培养。当菌丝长满培养基后，再移植纯化到新的培养基中，培育成母种。

（2.）孢子分离法 把采选的子实体用无菌水冲洗数次，用无菌纱布吸去表面水分，在接种箱中用经过消毒的钢丝钩上，悬挂或悬空于锥形瓶或钟罩中，送入恒温箱中保持20--26℃的温度，培养1~2天后，就看到培养基上有微暗的灰粉出现，就把子实体移出，让孢子在培养基上发育成菌丝，再移到试管培养基上，即得到母种。