质粒是细胞内的一种环状的小分子DNA，是进行DNA*的常用载体。在分子生物学实验中，通常将目的基因插入到质粒的多克隆位点上，构建新的*质粒，目的基因即可以随质粒载体进入到受体细胞中。获得高质量的质粒对下游实验起到非常重要的作用。
相信大家在刚进实验室还是个实验小白的时候，学的第一个实验大概率就是提质粒。跟在师兄师姐后面，认真的对每一步的步骤都做好笔记，后来才发现你自己不过是做了一份手写版的说明书。接下来的N年里，就是转化，涂板，挑单克隆，摇菌，提质粒，酶切，连接，好想能够有一个提质粒机器人，实现自动化生产。当我们习惯了省时省力，或许我们连提取的原理都已经忘了。
那小V带大家一起来回忆一下~
质粒提取主要包括三个步骤：菌体扩繁、菌体裂解释放质粒DNA、质粒DNA的分离与纯化。质粒提取方法中，最常用的是碱裂解法，它具有得率高，适用性广，快速，纯度高等特点。其原理是：
在氢氧化钠（pH12.0-12.6碱性环境）和去污剂SDS的作用下破坏细胞壁并裂解细胞，使宿主细菌蛋白质变性，线性的DNA双螺旋结构解开变性，共价闭合质粒DNA由于其分子量小且缠结紧密不易变性，氢键虽然断裂，但两条互补链彼此依然相互盘绕而紧密的结合在一起。加入酸性高盐缓冲液后pH恢复中性，共价闭合环状质粒DNA的两条互补链迅速而准确地复性，而线性的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，不能迅速而准确地复性，它们缠绕成网状结构。通过离心，变性的染色体DNA与不稳定的大分子RNA、细菌蛋白质、破裂的细胞壁相互缠绕成大型复合物被SDS包盖而被沉淀下来后被去除，上清中的质粒DNA可经过乙醇沉积或与硅胶膜特异性吸附等方法，将质粒DNA从上清中回收。
那么在提取过程中，大家是否遇到了各种各样令人头秃的问题，让人猝不及防，不知所措？今天小V竭尽所能给大家列出了若干个质粒提取的常见问题及解决方案，快来收下它，以备不时之需。
Q：影响质粒提取的要素有哪些?
A：质粒提取的纯度和得率与许多因素相关，比如：质粒本身的拷贝数、稳定性；宿主菌株的品种和培育条件；菌体投入量、菌体裂解是否充分、硅胶膜吸附性能；试验者操作的熟练度等等；这些都会影响到质粒提取。
Q：质粒的拷贝数由什么决定？
A：根据复制特性，质粒分严紧型和松弛型两类，严紧型质粒在宿主细胞中仅含有1-2个，它的复制与宿主细胞染色体受相同要素的操控，在一定的细胞周期内进行复制。严紧型质粒分子量较大，比如F质粒和P1质粒。而松弛型质粒在宿主细胞中含有十几个，乃至是几十个，在整个细胞周期中随时能够复制。松懈型质粒分子量较小，比如pBR322（15-20copies）、ColE1（20-30copies）、pUC（30-50copies）质粒。恒定的拷贝数与质粒复制控制系统、宿主细胞遗传背景及生长条件有关。质粒复制控制系统首先通过调节复制的起始点来控制拷贝数，调节因素包括阻遏蛋白、反义RNA和某些顺向重复序列。有些质粒还有其他控制系统，如有分配功能的par系统和确保质粒稳定遗传的ccd系统。一旦质粒上与调控有关的基因或位点突变，可使拷贝数明显增加或减少。
Q：为什么提不出质粒或质粒提取量很少？
A：
a.菌体中无质粒：
有些质粒本身不能在某些菌种中稳定存在，经多次摇菌后可能导致质粒丢失。
b.菌种老化：
如果是甘油保种菌，建议重新划线涂板活化，挑选单菌落后再进行菌体扩繁。
c.质粒拷贝数低：
某些质粒属于中低拷贝质粒（eg:大多数长片段质粒和表达型载体），也会导致质粒提取量低，尽量用相同功能的高拷贝质粒代替，或同时增加菌体和试剂的使用量。
d.裂解不充分：
质粒提取过程中，并非菌体量越高提取产量越高，投入过多的菌液，会导致菌体裂解不充分，可适当添加提取试剂的使用量或减少菌液投入量。此外，细菌须在裂解前充分重悬，否则成团的细菌因无法裂解也会使产量降低。
Q：质粒提取时，如何避免基因组污染呢？
A：基因组污染一般是因为操作过于剧烈导致的，比如选用涡旋振荡的方法进行混匀操作时，基因组DNA会被物理破坏成小片段，在中和过程中被复性，保留在上清中随质粒DNA一同被回收。所以在质粒提取过程中，动作要尽量温和。
Q：为什么有些质粒，纯化后长时间放置会降解？
A：发生这种现象的主要原因是核酸酶污染，除了在提取时可能引入了外源核酸酶之外，质粒宿主细胞也会影响抽提质量，如果宿主菌是end A (TG1，BL21，HB101，JM系列，ET12567等)，这些宿主菌含有大量的核酸酶，易降解质粒DNA，假如制备的质粒需要长时间保存，则建议替换宿主细胞为endA-宿主菌(DH5α，TOP10，XL1-Blue等)，用于质粒抽提。
Q：之前测序没问题的菌液，37 ℃扩大培育后，质粒的序列出现异常？
A：这种情况一般出现在大质粒或较特别的序列中，可能是质粒在大肠杆菌中复制时发生了*，可以将宿主菌替换为*酶缺失的菌株，比如JM109、sure菌株，使质粒复制愈加稳定。
Q：电泳检测质粒DNA条带长啥样？
A：
如下图所示，一般来说环形双链的质粒DNA分子具有三种不同的构型：
1．当其两条多核苷酸链均保持着完整的环形结构时，称之为共价闭合环形DNA（cccDNA），这样的DNA通常呈现超螺旋的SC构型；
2．如果两条多核苷酸链中只有一条保持着完整的环形结构，另一条链出现有一至数个缺口时，称之为开环DNA（ocDNA），此即OC构型；
3．若质粒DNA经过适当的核酸内切限制酶切割之后，发生双链断裂形成线性分子（IDNA），通称L构型；
如果提取的质粒污染比较严重，在电泳图上甚至还会看到宿主细胞的基因组和RNA污染。
图一.提取质粒产物1%琼脂糖凝胶电泳图
最后，如果屏幕前的你对于质粒提取还有什么问题或见解，不妨动动手指在下方的评论区留言哦，小V期待与您相遇。
