【实验目的】
（1）掌握几种常用的细菌染色方法。
（2）初步认识细菌的形态和结构特征。
【实验原理】细菌的个体形态主要分为球菌、杆菌和螺旋菌（图3-1）。有的细菌细胞除了细胞壁、细胞膜等基本结构以外，还具有芽孢、荚膜、鞭毛等特殊结构，是菌种分类鉴定的重要指标。由于细菌细胞既小又透明，直接在显微镜下观察时难以识别，故一般要经过染色才能做形态和结构的观察。用于生物染色的染料主要有碱性染料、酸性染料和中性染料三大类。在中性、碱性或弱酸性溶液中，细菌细胞通常带负电荷，而碱性染料在电离时带正电荷，所以很容易与细胞结合而使细菌着色，因此细菌染色多用碱性染料。常用的碱性染料有美蓝、结晶紫、番红、孔雀绿等。
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图3-1 细菌基本形态显微照片a．球菌；b．杆菌；c．螺旋菌细菌染色的方法很多，以下介绍几种常用的染色方法。
简单染色法：是利用一种染料对细菌进行染色的方法。该法操作简单方便，只适用于细菌形态和排列方式的观察。
革兰氏染色法：由丹麦病理学家Hans Christian Gram于1884年创立，是细菌学中最重要的鉴别染色法。各种细菌经革兰氏染色后，可分为革兰氏阳性菌（G＋）和革兰氏阴性菌（G-）两大类。其基本步骤分为：结晶紫初染，碘液媒染，乙醇（或丙酮）脱色和番红复染。一般认为，革兰氏染色原理与细菌细胞壁结构和组成有关。G＋菌细胞壁的肽聚糖层厚，类脂质少，当乙醇脱色时，肽聚糖因脱水而使网孔缩小，通透性降低，故能保留结晶紫-碘复合物在细胞膜上，细胞呈紫色；而G-菌细胞壁的肽聚糖层薄，类脂质多，乙醇将类脂质溶解，增加了细胞壁的通透性，结晶紫-碘复合物被溶出细胞壁，最后番红复染后使细胞呈红色。
芽孢染色法：芽孢是某些细菌在其生长发育后期，在细胞内形成的一个圆形或椭圆形的休眠构造（图3-2a）。细菌的芽孢具有厚而致密的壁，透性低，不易着色。芽孢染色法就是根据芽孢既难以被染色而一旦染上色后又难以脱色这一特点而设计的。用碱性染料孔雀绿在加热条件下染色，使染料不仅进入菌体，也可进入芽孢内。进入菌体的染料经水洗后被脱色，而芽孢一经着色后难以被水洗脱色，当用对比度大的复染剂染色后，芽孢仍保留初染剂的颜色，而菌体被染成复染剂的颜色，使芽孢和菌体易于区分。
荚膜染色法：荚膜是包围在细菌细胞外的一层黏状物质，其成分为多糖、糖蛋白或多肽。由于荚膜与染料的亲和力弱、不易着色，所以通常用负染色法染色，即菌体和背景着色，而荚膜不着色，在菌体周围形成透明圈（图3-2b）。由于荚膜含水量高，制片时通常不用热固定，以免夹膜变形，影响观察。鞭毛染色法：细菌的鞭毛极细，直径一般为10～20nm，只有用电子显微镜才能观察到（图3-2c）。但是，如采用特殊的鞭毛染色法，则在普通光学显微镜下也能看到它。鞭毛染色方法很多，但其基本原理相同，即在染色前先用媒染剂处理，让它沉积在鞭毛上，使鞭毛加粗，然后再进行染色。
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图3-2 细菌特殊结构显微照片（引自M.T.马迪根）a．细菌芽孢；b．细菌荚膜；c．细菌鞭毛
【实验器材】
1．菌种金黄色葡萄球菌（Staphy loccocus aureus）、大肠杆菌（Escherichia coli）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）、胶质芽孢杆菌（Bacillus mucilaginosus）、苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）或自备菌种。
2．染色液和试剂草酸铵结晶紫、卢哥氏碘液、95％酒精、番红、5％孔雀绿水溶液、绘图墨水、硝酸银染色液、二甲苯、香柏油等。3．仪器和用具废液缸、洗瓶、载玻片、接种环、酒精灯、擦镜纸、显微镜、小试管（75mm×10mm）、烧杯、滴管、玻片搁架、镊子、吸水纸、记号笔等。
【实验步骤】
1．简单染色法
（1）涂片：在洁净无油腻的玻片中央放一小滴水，按无菌操作的方法（图3-3）用接种环挑取少量金黄色葡萄球菌或大肠杆菌菌种与水滴充分混匀，涂成极薄菌膜。注意：取菌量要适当，且涂抹要均匀，避免因取菌太多而造成涂片细胞堆积难以看清细菌个体形态。
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图3-3 制备涂片的无菌操作过程a．接种环灭菌；b．拔管塞；c．管口灭菌；d．取菌种；e．管口灭菌；f．塞管塞；g．涂布；h．灼烧接种环
（2）干燥：让涂片自然晾干或用电吹风吹干。
（3）固定：手执玻片一端，让菌膜朝上，通过火焰两三次（以玻片背面不烫手为宜）。注意：必须等涂片干燥后再加热固定，且避免固定时间过长而使细胞形态破坏。
（4）染色：将涂片置于玻片搁架上，加适量（以盖满菌膜为宜）草酸铵结晶紫染色液染色1～2min。
（5）水洗：倒去染色液，用洗瓶小水流冲洗，直至涂片上流下的水无色为止。
（6）干燥：用吸水纸吸去水分，自然干燥或用电吹风吹干。
（7）镜检：涂片完全干燥后镜检，从低倍镜到高倍镜，最后用油镜观察。简单染色法的操作流程见图3-4。
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图3-4 细菌的简单染色法（引自M.T.马迪根）
2.革兰氏染色法
（1）制片：分别取金黄色葡萄球菌、大肠杆菌斜面培养物常规涂片、干燥、固定（同上）。注意：宜选用幼龄培养物，金黄色葡萄球菌和大肠杆菌培养约24h。涂片宜薄，以免脱色不完全造成假阳性。
（2）初染：滴加结晶紫（以刚好将菌膜覆盖为宜）染色1～2min，水洗。
（3）媒染：用碘液冲去残水，并用碘液覆盖约1min，水洗。
（4）脱色：将载玻片倾斜，在白色的背景下，用滴管流加95％乙醇脱色，直至流下的乙醇刚好无紫色时，立即水洗。注意：革兰氏染色成败的关键是乙醇脱色。如脱色过度，革兰氏阳性菌可能被染成假阴性；如脱色时间过短，革兰氏阴性菌也可能被染成假阳性。
（5）复染：用番红液复染约2min，水洗。
（6）镜检：干燥后，用油镜观察。
3．芽孢染色法
（1）制片：按常规方法将巨大芽孢杆菌涂片、干燥、固定（同上）。
（2）染色：加数滴5％孔雀绿染色液于涂片上，用木夹夹住载玻片一端，在酒精灯上方用微火加热，以染料冒蒸汽而不沸腾为宜，并开始计时，维持5min。注意：加热过程中切勿让染色液沸腾，并及时补加染色液，切勿让涂片干涸。
（3）水洗：待玻片冷却后，用水轻轻地冲洗，直至流出的水中无染色液颜色为止。
（4）复染：用番红液染色2min。
（5）水洗：用水洗去染色液。
（6）镜检：干燥后，用油镜观察。4．荚膜染色法
（1）制混合液：加1滴墨水于洁净的载玻片上，挑少量胶质芽孢杆菌菌体与其充分混合均匀。
（2）加盖玻片：放一清洁盖玻片于混合液上，然后在盖玻片上放一张滤纸片，向下轻压，吸去多余的菌液。注意：勿产生气泡，以免影响观察。
（3）镜检：先用低倍镜再用高倍镜观察。
5．鞭毛染色法（硝酸银染色法）
（1）菌种的准备：取经活化的幼龄苏云金杆菌菌种。
（2）载玻片的准备：将载玻片在含适量洗衣粉的水中煮沸约20min，取出用清水充分洗净，沥干水后浸于95％乙醇中，用时取出在火焰上烧去酒精及可能残留的油迹。（3）菌液的制备：取斜面菌种数环于装有1～2mL无菌水的试管中，制成菌悬液。
（4）制片：取菌液1滴滴于载玻片的一端，将玻片倾斜，使菌液缓缓流向另一端，用吸水纸吸去玻片下端多余的菌液，室温自然干燥。
（5）染色：涂片干燥后，滴加硝酸银染色A液覆盖3～5min，用蒸馏水充分洗去A液。用B液冲去残水后，再加B液覆盖涂片染色数秒至1min，当涂面出现明显褐色时，立即用蒸馏水冲洗。若加B液后显色较慢，可用微火加热，直至显褐色时立即水洗。自然干燥。
（6）镜检：干后用油镜观察，可从玻片的一端逐渐移至另一端观察。
【实验报告】
1．实验结果
（1）绘制金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的形态图，并注明两种菌的革兰氏染色结果。
（2）绘制芽孢杆菌形态图（示意芽孢位置）。
（3）绘制鞭毛细菌的形态图。
2．思考题
（1）进行革兰氏染色时，为什么特别强调菌龄不能太老，用老龄细菌染色会出现什么问题？
（2）观察芽孢、荚膜和鞭毛结构时，所用菌种菌龄有什么不同？（张应烙）
