专题一 基因工程

基因工程（原理：基因*）：（DNA*技术）按照人们的愿望，进行严格的设计，并通过体外DNA*技术和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。

一、基因工程的基本工具

（一）限制酶

1、来源：从原核生物中分离提纯。

2、功能：能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。

3、切割结果：（粘性末端和平末端）

【注】双酶切：

（1）防止目的基因和质粒自身环化。

（2）保证目的基因和质粒按照顺利连接。

（二）DNA连接酶

1、种类：

2、功能：将两条DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的磷酸二酯键。

【注】限制酶和DNA连接酶都作用于磷酸二酯键，而不是氢键。

（三）载体

1、结构：例如 质粒（见右图）

2、载体需要具备的条件

（1）能在宿主细胞内大量复制并稳定遗传。

（2）具有一个至多个限制酶酶切位点，以供外源DNA片段（即目的基因）插入其中。

（3）有特殊的标记基因（例如抗生素抗性基因），供*DNA的鉴定与选择。

3、常用载体：（1）大肠杆菌的质粒（天然质粒经过人工改造）。

（2） 噬菌体衍生物和动植物病毒。

【需要通过载体而不能直接将目的基因导入受体细胞的原因：基因表达载体包括复制原点、启动子、终止子等结构，而目的基因没有。】

二、基因工程的基本操作程序

（一）目的基因的获取

1、目的基因：为了获得预期性状，需要从供体细胞中获得的基因，主要指编码蛋白质的结构基因，也可以是一些具有调控作用的因子。

2、

（1）基因文库：将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储备。各个受体菌分别含有这种生物的不同基因。

【注】：真核细胞的基因有内含子和外显子（如图）

（2）PCR技术

【前提：要有一段已知目的基因的核苷酸序列（目的是为了设计引物）】

①原理：DNA双链复制（生物体外复制特定DNA片段的技术）

②材料：模板、原料（四种脱氧核苷酸dATP、dGTP、dCTP、dTTP）、热稳定DNA聚合酶（Taq酶）、引物（成对存在）

③扩增过程：

a.变性（90-95℃）：使DNA片段双链解开。

b.复性（55-60℃）：又称为退火，使连接DNA两条单链分别与相应的引物结合。

c.延伸（70-75℃）：热稳定DNA聚合酶催化引物起始合成子链。

④PCR技术与DNA复制的比较

DNA体内复制 PCR技术

解旋方式 解旋酶催化 DNA在高温下变性解旋

场所 细胞内 体外

酶 解旋酶、DNA聚合酶 热稳定DNA聚合酶

温度 细胞内温和条件 需要控制温度

合成对象 DNA分子 DNA片段或基因

（二）基因表达载体的构建——基因工程的核心

1、目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时，使目的基因能够表达和发挥作用。

2、基因表达载体的组成：（如右图）

（1）插入基因：即目的基因

（2）启动子：一段特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，是RNA聚合酶识别和结合的部位，能驱动基因转录。

（3）终止子：一段特殊结构的DNA片段，位于基因的尾端，使转录在需要的地方停止下来。

（4）标记基因：用于鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。常用的标记基因是抗生素抗性基因、产生特定颜色表达产物的基因、发光基因等。

（5）复制原点：载体在受体细胞中复制的起点。

3、基因表达载体的构建过程：（如右图）

4、基因表达载体去向：

（1）留在受体细胞中进行自我复制。

（2）整合到受体细胞染色体DNA上。

（三）将目的基因导入受体细胞

1、转化：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。

2、 （1）受体细胞为植物细胞

①农杆菌转化法：目的基因插入Ti质粒的T-DNA上→农杆菌→农杆菌侵染植物（双子叶植物受伤后产生酚类物质，吸引农杆菌进入植物细胞）细胞→整合到受体细胞的染色体DNA上→表达。

【原理：目的基因随农杆菌中Ti质粒上的T-DNA转移到受体细胞，并整合到受体细胞染色体的DNA上】

②基因枪法：利用压缩气体产生的动力，将包裹在金属颗粒表面的表达载体DNA打入到受体细胞中。

③花粉管通道法：在植物受粉后，花粉管未愈合时，剪去柱头，滴加含有目的基因的DNA。

（2）受体细胞为动物细胞

显微注射法：将含有目的基因的表达载体提纯→从雌性动物体内取出卵（体内或体外受精）→显微注射→将注射了目的基因的受精卵经早期胚胎培养一段时间后，移植到雌性动物体内。

（3）受体细胞为微生物细胞

①原核生物作为受体细胞的优越性：繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少。

②氯化钙法(感受态细胞法)：Ca 处理细胞→感受态（易于吸收周围的DNA分子）细胞→*表达载体与感受态细胞混合→感受态细胞吸收DNA分子。

（四）目的基因的检测与鉴定

1、分子水平检测

（1）转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因

——DNA分子杂交技术

（在含有目的基因的DNA片段上用放射性同位素等做标记，作为探针。）

（2）目的基因是否转录出mRNA

——分子杂交技术

（3）目的基因是否翻译成蛋白质

——抗原-抗体杂交技术（原理：抗原抗体的特异性结合）

2、个体水平检测

——例如：抗虫接种实验

三、基因工程的应用

（一）植物基因工程

1、抗虫转基因植物：从某些生物中分离出具有*虫活性的基因，将其导入作物中，使其具有抗虫性。用于*虫的基因主要是Bt毒蛋白基因（例如我国的抗虫棉）、蛋白酶抑制剂基因、淀粉酶抑制剂基因、植物凝集素基因等。

2、抗病转基因植物：抗病转基因植物所采集用的基因，使用最多是病毒外壳蛋白基因和病毒复制酶基因；抗真菌转基因植物中可使用的基因有几丁质酶基因和抗毒素合成基因。

3、抗逆转基因植物：例如：抗寒、抗旱、抗除草剂等。

4、利用转基因改良植物品质：（1）高赖氨酸含量的玉米。（2）耐储存的番茄。

（二）动物基因工程

1、提高动物生长速度。

2、改善畜产品的品质。

3、转基因动物做器官移植的供体

4、转基因动物获取药物：乳腺生物反应器

（三）基因工程药物：例如干扰素

（四）基因治疗：把正常基因导入病人体内，使该基因的表达产物发挥功能，从而达到治疗疾病的目的。

四、蛋白质工程的崛起

（一）蛋白质工程的概念：

蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作基础，通过基因修饰或基因合成，对现有的蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产和生活的需求。

【注】基因工程在原则上只能生产自然界已存在的蛋白质，蛋白质工程理论上可以产生自然界不存在的蛋白质。

（二）蛋白质工程的原理及流程：

1、前提：了解蛋白质结构和功能的关系。

2、基本途径：根据预期蛋白质的功能，设计蛋白质的结构，推测应有的氨基酸序列，找到相对应的脱氧核苷酸序列。（A为转录，B为翻译）

3、蛋白质工程的主要问题：蛋白质发挥功能必修依赖于正确的高级结构，而这种高级结构十复杂，现阶段人们对其认识不足。

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